过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族活性的影响

摘要：

研究在HeLaS3细胞中过表达Lin28a/Lin28b对let 7家族miRNA表达水平和活性的影响.首先,构建Lin28a和Lin28b的表达载体pAAV2neo-Lin28a和pAAV2neo-Lin28b,分别转染HeLaS3细胞并筛选获得Lin28a和Lin28b的稳定表达细胞株HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b.然后,以pAAV2neo-Gluc-(Fluc)为基本骨架,构建并获得检测let 7家族miRNA活性的8种质粒型载体,并包装为相应的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV),作为检测miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的传感器,命名为Asensor.在此基础上,以HeLaS3细胞为对照,用Western blot检测HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中Lin28a和Lin28b表达水平,用QRT PCR测定let-7家族各成员表达水平,用Asensor检测let-7家族各成员活性.Western blot结果显示,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b均能有效地表达Lin28a和Lin28b蛋白；QRT-PCR检测结果显示,相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞中let-7家族各成员表达水平都下降(除let-7e外),但不同成员下降幅度存在差异；Asensor检测结果显示,let-7家族所有成员活性水平都下降,但不同成员下降幅度也存在差异,且同一成员活性水平与表达水平及其下降趋势也不一致.相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中let-7家族成员的表达和活性水平均明显下降,但表达水平的下降幅度比HeLaS3/pAAV2neo Lin28a细胞大,而活性的下降幅度却与之相近.本研究建立了一种检测和比较miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的方法,首次研究了过表达Lin28a和Lin28b对细胞中的let 7家族miRNA活性影响,并发现Lin28a和Lin28b对let-7家族miRNA表达水平的影响和对其相应活性的影响不一致性,说明在检测miRNA表达水平的同时检测miRNA活性能更全面揭示miRNA的调节功能,为进一步研究let-7家族的调控机制奠定了基础.

关键词：Lin28a、Lin28b、let-7家族、活性、过表达

所属期刊栏目：27

分类号：Q52;R373.2(核酸)

资助基金：肝炎相关肝癌生物治疗新途径新制品的研究和应用;国家重点实验室开放基金

在线出版日期：2012-03-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：533-541