双萤光素酶共表达载体构建及特性研究

摘要：

利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究.采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆人表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Glue-2A-Fluc.将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Glue 98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳.用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCA＆-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Glue的表达情况.活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30 min内都比较稳定.本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Glue-2A-Flue质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性.又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性.

关键词：Gaussia萤光素酶、萤火虫萤光素酶、TaV 2A、水动力注射、共表达

所属期刊栏目：26

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家科技重大专项;国家科技支撑计划;国家重点实验室开放基金

在线出版日期：2010-09-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：276-282