10.3321/j.issn:1000-8721.2001.01.014
伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gG-/LacZ+突变株的构建
为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK1-4,进一步改造成为转移质粒pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK-/LacZ+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞,待完全病变后,收毒作空斑试验,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化3次,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的无TK-/LacZ+突变株污染的TK缺失的重组病毒。分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增,扩增产物经酶切分析和测序后发现:TK缺失重组病毒的TK基因缺失了205个碱基,XhoI和SalI位点消失,SmaI酶切片段发生变化。两种病毒在PK-15细胞上形成空斑的大小和增殖的滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA,与含gG-LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK-15细胞,待完全病变后,在X-gal存在下筛选蓝斑,将挑取的蓝斑纯化3次后,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段,同时又能扩增出LacZ基因,证实所得到的重组病毒为TK-/gG-/LacZ+突变株。此双缺失突变株的构建成功,为在我国最终根除伪狂犬病提供了有用的工具。
伪狂犬病病毒、鄂A野毒株、TK-/LacZ+突变株、TK缺失突变株、TK-/gG-/LacZ+突变株
17
S852.65(动物医学(兽医学))
国家科技攻关项目96-C01-04-03
2004-01-08(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
共6页
69-74