细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定

摘要：

目的 设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能.方法 根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定.将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Real time RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果 成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平.结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达.成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础.

关键词：CDCA3蛋白、RNA干扰、shRNA、载体构建

所属期刊栏目：33

分类号：R730.231;Q78;TN911.22

资助基金：国家重大科学研究计划;国家自然科学基金

在线出版日期：2012-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：136-140