质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响

摘要：

背景与目的:探讨影响嵌套缺失反应的重要因素,找出相应的解决方案.材料与方法:以构建好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL)基因5'端调控区质粒pGLB-G6为研究对象,采用碱裂解法、聚二乙醇纯化法及QIAGEN试剂盒等3种不同方法制备该质粒,分别研究ExoⅢ对它们进行非特异性切割的敏感性,选出对ExoⅢ不敏感的质粒制备方法;在22℃和37℃分别进行缺失反应,琼脂糖凝胶电泳监控,以确定缺失反应是否已经发生;应用PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子.结果:QIAGEN试剂盒制备的质粒对ExoⅢ的非特异性切割最不敏感,可用于进行下一步的缺失反应;在22℃进行缺失反应时,电泳鉴定发现DNA片段的长度没有明显的变短,而在37℃时,同一反应体系的DNA片段长度明显缩短;进一步用限制性内切酶酶切可筛除PCR中的假阳性,获得准确的缺失子.结论:质粒的质量是确保进行特异性缺失反应的关键因素,通过QIAGEN试剂盒制备的质粒质量较好;设立一个37℃缺失对照管可作为判断低温条件下是否发生缺失的标准;PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子,可确保获得特异的缺失子.

关键词：嵌套缺失技术、影响因素、NGAL基因

所属期刊栏目：17

分类号：Q784(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金39900069,30170428,30370641;广东省自然科学基金37788;广东省自然科学基金990799,010431

在线出版日期：2005-04-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：79-82