122. 建立RDPCR技术检测p53基因的DNA损伤

摘要：

目的：设计、建立并初步评价能检测特定基因DNA损伤的随机末端连接物依赖的PCR（Randomized Terminal Linker－Dependent PCR，RDPCR）新技术。方法：培养TK6细胞并提取基因组DNA。用PCR技术扩增186bp的p53基因外显子7，以凝胶回收纯化的扩增产物为模板，再进行新的PCR反应标记地高辛探针，标记探针被电泳和定量。用限制性内切酶AfaI完全消化基因组DNA建立损伤模型；经过p53基因外显子7的特异性引物P1重复直线延伸，与一带有3′随机粘性末端的双链公共连接物（Linker）在T4 DNA连接酶作用下连接后，用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR指数扩增；琼脂糖电泳，真空转印至带正电荷的尼龙膜上，再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果：p53基因外显子7的扩增条带清晰，特异。标记探针的电泳速度稍慢于未标记片段；定量为50 μg/μl。RDPCR结果表明，使用3′末端阻止的Linker可见在相应位置出现了清晰的目标带，而未阻止的由于Linker的自身连接显色信号微弱；灰度计量显示RDPCR的信号强度是传统的连接介导聚合酶链反应（Ligation－mediated Polymerase Chain Reaction，LMPCR）的7倍，但其背景稍高。结论：RDPCR是在LMPCR、单链连接PCR(Single-strand Ligation PCR，SLPCR）和末端转移酶依赖的PCR （Terminal transferase-dependent PCR，TDPCR）技术上设计的新的体外扩增技术，可以有效检测特定基因的DNA损伤。它可能克服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷，如应用局限、连接效率低和定位不精确等，更为灵敏、简便、快速和适用。结合Maxam-Gilbert化学测序技术，RDPCR还能在核酸序列水平检测特定基因的DNA损伤，包括DNA加合物、链断裂和氧化损伤等，有很好的应用前景。

关键词：RDPCR、LMPCR、p53基因、DNA损伤、地高辛标记探针

所属期刊栏目：13

分类号：R994(毒物学（毒理学）)

资助基金：国家自然科学基金30070648

在线出版日期：2004-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

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